犬基因组研究进展

作者：李小慧，徐汉坤，张汇东，马大君，缪 勤，杨利国

【摘要】：人类基因组计划逐渐发展成熟使比较基因组学研究成为必然。犬由于具有遗传多样性和疾病易感性等特点，是一个极好的比较基因组学的动物模型。

• 【关键字】：
• 犬；基因组图谱；基因组测序；比较基因组

• 【参考文献】：
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犬基因组研究进展

李小慧¹，徐汉坤² ，张汇东²，马大君²，缪 勤²，扬利国³(1.南京农业大学动物科技学院，江苏南京210095；2.公安部南京警犬研究所，江苏南京210012，3华中农业大学动物科技学院，湖北武汉430070)摘要：人类基因组计划逐渐发展成熟使比较基因组学研究成为必然。犬由于具有遗传多样性和疾病易感性等特点，是一个极好的比较基因组学的动物模型。在此，综述了犬基因图谱、基因组测序、犬基因组比较图谱及犬基因组研究应用等方面的研究进展。并提出目前研究中面临的问题。
关键词：犬；基因组图谱；基因组测序；比较基因组
The Progress On Dog Genome ProjectLi Xiaohui^l，Xu Hankun²，Zhang Huidong²，Ma Dajun²，Miao Qin²，Yang Liguo ³(1.College of  Ardmal Science and Technology,Nanjing  Agriculture University ，Nan jing 210095；2. Nanjing Policedog Institute of  the Ministry of  Public Securay，N an-jing 210012：
3.College of  Animal Science and Technology,Huazhong Agriculture University，Wuhan 430070)
Abstract：Human Genome Project advanced the research on comparative genomics．Dog，which characters  with a panoply of morphological and behavioral genetic differences and susceptibility of some diseases，have been regarded as a excellent animal model of comparative genornics．This papers reviewed that the
development of gene map，dog genome sequencing，comparative map and the application of dog genome  research．The problems of dog genome research were put forward lastly．
Key words：Dog，Genome map，Genome sequencing，Comparative genomics 在基因组计划启动之初，犬并未作为基因组研究的模式动物，另外犬也不属于重要的农业经济动物，因此与人类、小鼠、猪和牛等动物相比，犬基因组相关研究开展相对滞后。20世纪90年代末以来，在比较基因组研究的推动下，犬基因组发展非常迅速，2003年9月EwenF．Kirkness在《Science》上首次公布了犬基因组的草图，使得犬成为继人类和鼠之后第一个享受基因组测序的哺乳动物^[1]。
1犬基因组组成    犬的基因组由38对常染色体和1对性染色体组成。性染色体都为双臂，x染色体较大，为亚中间着丝粒型，而Y染色体是所有犬染色体中最小的，为中间着丝粒型。38对常染色体都属于近端着丝粒类型染色体，形状和大小非常接近，难以区分。1996年犬染色体核型委员会一致通过了Switonski发表的1～21号染色体和性染色体标准化核型^[2]，同时推荐用染色体特异卫星探针^[3]和Rcimannd的核型区分法^[4]去区分22—38对染色体。犬的全部染色体核型区分方法的建立使原来建立的犬遗传连锁图谱、物理图谱和细胞遗传图谱得到整合，促进了犬基因组作图的发展。基盒项目：公安部B类项目“中国犬资源调查研究”(20039729505)资助．
第一作者筒介：李小慧，女，1980年2月出生，黑龙江铁力人。博士研究生，研究方向：动物繁殖与分子遗传学。E-mail：lxhl52706@yahoo.com.cn，Tel；-84395306。通信地址：210095南京农业大学动物科技学院2003级博士。
通讯作者：杨利国．男，1962年8月，湖南邵阳人，教授，研究方向为动物繁殖育种。Tel： 027—87281813．025E-mail：ylg@hazu cdu．cn。
收稿日期：2005-09-15。

2犬基因组作图尽管犬基因组作图起步相对较晚，但借助于人类基因组作图的技术，犬基因组作图近几年发展尤为迅速。人类和其它一些生物物理图谱的发展总是落后于遗传连锁图谱，而犬的遗传连锁图谱和物理图谱几乎是同步发展。迄今为止，已公布的基因图谱多为遗传连锁图和物理图谱的整合图。
2．1作图标记   根据Priat等，犬基因组作图标记可分为两大类，I型和II型标记^[5]I。I型标记(gene-based markers)为编码序列，包括犬的基因、犬的EST(表达序列标签)、人的EST等标记。Ⅱ型标记是非编码的重复序列，即微卫星标记。微卫星标记是制作遗传连锁图谱、放射杂交图谱的主要标记。到目前为止，应用到犬基因组作图的标记总共有3,270个，其中有1，596个微卫星标记和900个I型标记。除了上述两型标记，还增加了668个BAC-end markers(细菌人工染色体末端序列标记)和106个STS(序列标签位点) ^[6]。随着新的遗传标记的开发和应用，定位的标记密度将不断提高，最终使遗传连锁图谱和物理图谱的精度提高。
2．2遗传图谱和物理图谱   1997年Lingaas等公布了第一张遗传连锁图谱，16个连锁群共包含43个位点，仅仅第13和16个连锁群被定位到染色体上^[7]。同年，Mellersh等报道了共有30个连锁群包含139个标记的遗传连锁图谱，标记间平均距离为14．03 cM，所有连锁群大约覆盖2079cM^[8]。1999年，在Mellersh绘制的图谱基础上，Mark等用276个标记构建了第二代遗传连锁图谱，标记间平均距离为10 cM，整个图谱大约覆盖了犬基因组的75％．一90％^[9]。Werner报道的连锁图遗传标记为341个，分布于37对常染色体和X染色体上，连锁群覆盖整个基因组的95％，标记之间的平均距离是9,0 cM，并通过FISH(荧光原位杂交)方法将14个连锁群定位到染色体上[^10]。犬物理图谱制作主要采用FISH^[ll]和RH(放射杂交)作图技术，通过上述方法还能将I型和II型标记从连锁图转移到物理图上。Vignaux等在1999年开始着手犬物理图谱制作的基础工作，他们构建了放射杂交细胞系RHDF5000和基因组DNA文库^[12]。随后，这个研究小组公布了犬全基因组的放射杂交图谱，这个放射杂交图谱包括400个标记，标记间平均距离是3．8Mb^[5]。犬的放射杂交制图技术成熟之后，许多研究小组所公布的都是遗传图谱和连锁图谱的整合图谱。Mellersh进一步发展放射杂交图谱，将作图标记增加到600个，将其与Wemer^[8]的遗传连锁图谱整合后，使原来77个RH群合并成44个^[13]。同样，Breen^[14]结合Wemer^[11]的连锁图谱，绘制了包含350个遗传标记的连锁图谱，得到39个连锁群，并将这39个连锁群定位到染色体上。这39个连锁群覆盖6、17、19、21、24、32、34、36、X号染色体10％-60％长度，覆盖了其他染色体的全长。但将连锁图与RH图整合后，没有覆盖的区域只有X和32号染色体的50％以及36号染色体的三分之二。最近Guyon公布的犬基因组放射杂交图谱^[6]，共有3，270个标记，所有标记被定位到3,021个位点，标记间平均距离为l Mb。这个相对高精度的物理图谱成为犬基因组计划的测序框架。查找犬的所有基因组标记和基因组图谱可查阅以下网站www-recomgen．univ-rennesl，fr／doggy．html和www．fhcrc．org／scienc／dog—genome／dog，html。
2．3基因组测序   在2003年6月国家人类基因组研究所会议上宣布启动犬基因组测序(http：／／www．genome．gov／11007358)。而2003年9月来自美国Rockville的两个研究小组：基因组研究所和基因组发展中心发表了犬基因组测序和比较分析的结果^[1]。他们采用鸟枪法测序策略，将6．22百万个读序组装成1．9百万个重叠克隆群(contigs)和0．85万个单序列读序(singletons)，经过排序和定位后生成522，101个支架(scaffolds)。利用Guyon的放射杂交图谱将支架群定位到染色体上。测序工作量为犬基因组的1．5倍，基因组覆盖率达78％以上。估计整个常染色质基因组大小为2．31到2．47Gb，基因组序列中约31％为重复序列，1．9％为编码区。在1．5Gb序列中推测有974,400个SNP(单核苷酸突变位点)，也就是大约1500个碱基有1个SNP位点。在所有的SNPs中，有27％通过BLASTN定位到人类的染色体上，其中有2／3靠近14，679个人类基因的编码区或包含其中^[2]。据估计，至少650 Mb的犬DNA序列在捧列上与人基因组序列有差异。
2．4比较基因组图谱   犬比较基因图谱研究主要集中在犬与人的比较图谱上面，犬与其他动物的比较基因组研究也有所开展。采用动物园杂交方法(Zoo-FISH)，将人类的染色探针用于犬染色体，研究人类和犬之间的保守染色体片段，两个研究小组分别得到68个^[15]和73个^[16]，这种差异可能是由于应用不同的染色探针引起的。Sargan等绘制了一套I型标记并应用犬源探针重复了犬／人类染色体比较图谱研究，证实了上面第二个研究结果^[17]。犬连锁和放射图谱整合促进犬和人基因组染色体保守片段的发现。通过RH作图将229个基因在染色体上定位，这些基因在人类染色体上的位置已知，比较结果显示出人和犬共有65个保守片段^[18]。最新的犬放射图谱揭示了85个犬／人类保守片段^[6]。动物园杂交方法还被应用于犬与红狐^[16] 、北极狐^[19] 、猫渊^[20] 、日本狸^[21]和中国狸^[22]因组的比较研究。不同动物确定保守染色体片段数量分别为：猫68个、红狐43个、北极狐42个和狸41个。另外将1．5倍覆盖度的犬基因组和8倍覆盖度的鼠基因组与人的基因组比较，发现在人基因组中已经注释的转录产物和基因中，犬的转录产物(29，529)和基因(18,473)与鼠的转录产物(29，529)和基因(18，311)的序列同源性大致相同。这可能是鼠和犬与人有共同起源的基因在鼠上有较高的丢失率和突变率的原因。比较这三个基因组，发现鼠的碱基突变率是人和犬的两倍，因此人和犬的基因组之间比人和鼠或者犬和鼠之间更相似；比较这三个生物基因组的同源序列群(clusters of orthologous bases，COGs)也证实这点^[1]。

3犬基因组研究的应用前景    3．1认识哺乳动物生长、发育及进化的遗传本质   在15，000到lo，000年的驯化过程中，人类根据不同的需要和使用目的，培育出了形态、行为差异很大且用途不同的犬品种。据估计，目前大约有400多个犬的品种^[23]。另外，为了保持某一品种的相对稳定性，犬的繁育被严格控制。现在许多品种都是为了得到某种特征从几个祖先培育而来，现有品种间表型虽然差异很大，但在基因型上，却具有较高的同质性，少数关键基因决定品种之间的表型差异。因此，犬的特殊群体结构使其成为研究形态、行为等的多样性和哺乳动物进化遗传基础的良好模型。比较犬、人和鼠三种生物的基因组，发现犬与人、犬与鼠的保守性非常高。比较三者的保守同源群和一致的重复序列，发现犬比人和鼠更早从三者的共同祖先中分化出来，进一步阐明了生物进化规律。将犬与人或鼠的特定基因比较，可以从基因角度解释不同生物相同生理功能的差异。例如，犬比人类拥有更庞大的嗅觉受体基因家族，可能解释犬的嗅觉比人类灵敏的原因^[1]。Chase对决定犬骨骼发育的基因进行QTL研究，发现不同骨骼的调节基因相互促进和制约的规律^[24] 。因为犬具有较明确的系谱，形态上具有较高的多样性，便于开展相关性状的QTL(数量性状定位)研究。将其作为研究家畜的数量性状的动物模型，探讨多基因性状的作用机理具有广阔前景。
3．2疾病基因定住位   为了尽可能地分离和固定某一品种特有性状，犬的培育经常采用近交纯繁方式，这导致了犬有大约400多种遗传疾病。包括单个基因突变引起的遗传疾病和多基因位点决定遗传疾病。犬基因组研究的一个重要目标是寻找决定这些疾病的基因并建立疾病基因诊断方法。目前己成功定位了犬多种遗传疾病的决定基因。根据Patterson的报道^[25] ，21种遗传疾病的决定基因的已经明确。其中5种为X-连锁隐性遗传突变，包括B型血友病、幼犬颤抖中枢神经系统脱髓鞘、营养障碍基因性肌肉营养不良、肾病和严重的联合免疫缺陷。其他16种为常染色体隐性遗传突变，包括椭圆形红细胞性贫血．红细胞形态异常、肌肉磷酸果糖激酶缺乏、I型粘多糖贮积病、I型视椎杆状细胞发育不全、红细胞丙酮酸激酶缺乏、球状体细胞性脑白质营养不良、岩藻糖苷贮积病、IA型肝糖贮积病、VII型粘多糖贮积病、夜盲症、补体缺乏、3型Von Willebrand氏疾病、3型视椎杆状细胞发育不全、嗜眠病、白细胞粘连不足、先天性肌强直。最近3年，在犬基因图谱迅速发展的基础上，通过对患病家系的连锁分析，另外一些单基因遗传疾病被确定。包括伊维菌素敏感症^[26] 、泛发性视网膜进行性萎缩症^[27] 、IIIA型粘多糖贮积病^[28] 、恶性高热^[29] 、色素性视网膜炎^[30] 、奥尔波特综合征^[31] 、色盲^[32] 、A型血友病^[33] 、营养障碍大疱性表皮松解症^[34] 和铜中毒^[35] 。在所有犬的遗传疾病中，至少50％有品种特异性，因此仅能在几个品种犬找到引起某种遗传疾病的突变基因。另一方面，在一些犬品种中却发现两种或两种以上的遗传疾病。例如，英国史宾格犬有3种(岩藻糖苷贮积病、肌肉磷酸果糖激酶缺乏、颤抖幼犬的中枢神经系统脱髓鞘)和爱尔兰塞特犬(A型血友病、白细胞粘连不足、I型视锥细胞发育不全)。西部高地白梗有两种(球状体细胞性脑白质营养不良、红细胞丙酮酸激酶缺乏)，凯安梗(球状体细胞性脑白质营养不良、B型血友病)和威尔斯柯基犬(3型视锥细胞发育不全，X-连锁的严重的联合免疫缺陷)。多基因遗传病的致病因素比较复杂，不仅取决于遗传背景，而且后天因素也对疾病发生起着重要作用。对犬影响较大的多基因遗传病是髋关节发育异常和癫痫症。对于多基因遗传疾病研究主要采用数量性状定位(QTL)研究方法，犬髋关节发育异常和癫痫症的QTL研究已经开展^[36.37] ，并定位了与癫痫症有关的三个染色体片段。
3．3人类疾病的动物模型    人类遗传疾病和癌症遗传表现通常很复杂，由于人类家系小且不能有目的地控制，限制了遗传机理的分析以及治疗方法的研究。目前主要以小鼠为模型来研究人类疾病，但是小鼠的遗传突变通常为诱导而非自然产生，并且小鼠生命周期短，不适合作为慢性遗传病模型^[38] 。由于上述原因以及小鼠和人类在生理上、疾病表现的差异，在一定程度上限制了对人类相关疾病的研究。犬则克服了小鼠的上述缺点，并且作为一种伴侣动物犬与人类具有相同的生活环境，家系也可以自由控制，因此，可以作为人类疾病良好的动物模型。犬的许多遗传疾病在分子水平上大多数都有相对应的人类疾病，犬的一些疾病甚至和人致病基因相同。下列疾病与人类疾病名称相同，包括B型血友病、3型Von WiUebrand氏疾病、粘多糖贮积病I型和VII型和嗜眠病等。其他的名称不同：营养障碍基因性肌肉营养不良与人类的杜兴肌营养不良、夜盲症与人类的莱伯先天性黑蒙等。另外，铜中毒与人的Wilson's病病理表现十分相象，犬的遗传性肾炎和扩张性心肌症^[39] 常被用做研究人类相应疾病的发病机理。据估计，至少60％犬的遗传疾病与那些特殊的人类疾病的分子生物学背景或临床极为相似。对于已经明确决定基因的遗传疾病，许多研究者开展基因治疗实验。通过向失盲犬视网膜下或玻璃体内注射以腺病毒为载体的重组表达犬野生型RPE65基因cDNA，发现犬视觉功能恢复^[40] 。另外类似的试验中，接受治疗的犬视力得到长期改善^[41] 。给患粘多糖贮积病VII型的新生犬仔静脉注射一种重组表达犬葡萄糖苷酸酶基因的逆转录病毒载体，成功的防止了这种溶酶体贮积病临床症状的出现^[42] 。Beaty等给3头患粘多糖贮积病VII型病犬静脉注射重组表达犬野生型葡萄糖-6-磷酸酶基因cDNA的腺联病毒，基因在犬体内持续表达，生化参数和肝的组织学结构也有改变^[43] 。
A型血友病^[44]和B型血友病^[45]也应用相应的基因治疗方法得到纠正。犬癌症的发病率是人的两倍，多为自然发生并具有遗传性。犬的许多癌症如淋巴瘤和骨髓瘤等与人类癌症在病理、临床表现和对治疗的反应等方面比小鼠更相象，所以建立犬的癌症模型不仅可以深入了解癌症的发病机理，而且在研究癌症的易感性和开发癌症的治疗手段方面都将发挥巨大的作用^[46] 。应用分子细胞遗传技术研究犬淋巴瘤^[47,48] ，结果表明，13号染色体最常发生畸变，接着31号染色体，而且14号染色体也出现缺失。犬13号染色体在进化上与人类染色体8q和4p相对应，在这两个人的染色体片段上有两个致癌基因(c-MYC和c—KIT)，通常被人类的非何杰金氏淋巴瘤激活。不同的癌症的发生有种间特异性。在某些犬种，特定癌症的发生频率高于其他品种。例如，大型品种犬(爱尔兰猎狼犬，圣伯纳，大丹，罗特威尔犬，爱尔兰塞特犬，杜伯文)患骨肉瘤的风险比小型犬高。因此，可以利用犬的家谱寻找引起犬品种特异的癌症的基因突变。最近，根据庞大的德国牧羊犬的家谱资料，将犬肾癌(多病灶性肾囊腺癌和结节状皮肤纤维化)的决定基因座定位到5号染色体上。比较犬和人的染色体，显示该染色体与人类染色体1p和17p具有同源性^[49] 。
4面临问题和展望   尽管可以从1．5倍覆盖度的犬基因组测序中获得大量信息，但其局限性却不可忽视。例如，信息丢失率高，绝大多数已发现的基因是不完整的片段，间隙太多等等。诚然，这些问题可以通过建立更多标记、更高精度的放射杂交图谱得到解决。美国的NHGRI(国家人类基因组研究协会)正在预期完成更高覆盖度(6．5x)的测序。另外，相对于高精度的基因组草图而言，完全测序的犬基因很少。目前，放射杂交图谱／遗传连锁图谱／细胞遗传图谱中使用的标记绝大多数是具有高度多态性的微卫星标记(II型标记)，应用这些标记可以确定疾病基因位点。但是，对于比较作图以及根据染色体上疾病基因位点确定疾病的候选基因而言仍然需要基因标记(I型标记)。现在，已经可以利用现有基因组测序结果提供的基因片段寻找STR和SNP，寻找疾病和表型的侯选基因．也可从基因片段中分离出cDNA，进一步完成基因测序。影响犬作为疾病模型发展的另一个因素，是犬的繁殖技术研究进展缓慢。目前，有关犬诱导发情、超数排卵、同期发情、克隆、胚胎移植、干细胞生产等技术的研究进展相对滞后，因此应用转基因和基因敲除技术建立的犬实验动物模型还不是很容易能够获得。究其原因是目前对犬的繁殖生理缺乏足够的了解和认识，因此解决这一问题的根本是开展对犬繁殖机理研究。