犬巴贝西虫病PCR检测方法的建立

作者：尚泽松，李小康，王雪莹，张才，江丰伟，赵艳辉

【摘要】：为快速、准确检测犬巴贝西虫病，根据GenBank中收录的犬的巴贝西虫18sRNA基因序列，设计合成1对特异性诊断引物，建立了PCR诊断方法.

• 【关键字】：
• PCR；犬；巴贝西虫；18sRNA基因

• 【参考文献】：
• [1]刘跃生．宠物犬巴贝斯虫病的调查与防治[j]．畜牧与兽医，2002，34(11)：35—36． [2]Almeria S，Castella J，Ferrer D，et a1．Bovine piroplasms in Minorca(Balearic Islands，Spain)：acomparison of PCR—based and light microscopy detection[J]．Veterinary Parasitology，2001，99(3)：249～259． [3]石云良，黄维义，张为宇，等．二重PCR快速检测牛伊氏锥虫和牛巴贝斯虫的研究[j]．广西农业科学，2010， 41(2)：163—166． [4]董君艳，王力光，娄红军．犬吉氏巴贝斯虫病的胎盘传播及综合防治[J]．畜牧与兽医，2001，33(1)：26—27． [5]徐云翔．姚开保，朱志明．犬巴贝斯虫病的诊治报告[J]．当代畜牧，2002(2)：30． [6]吴位珩，杨茂生，廖明，等．牛双芽巴贝斯虫PCR检测方法的建立及初步应用[J]．畜牧与兽医，2009，41(9)：78-80． [7]简子健，马素贞，孙其喆。等．牛双芽巴贝斯虫巢式PCR诊断方法的建立[J]．新疆农业科学．2010，47(4)，803-807

犬巴贝西虫病PCR检测方法的建立

尚泽松，李小康，王雪莹，张  才，江丰伟，赵艳辉
(河南科技大学动物科技学院，河南洛阳471003)

摘要：为快速、准确检测犬巴贝西虫病，根据GenBank中收录的犬的巴贝西虫18sRNA基因序列，设计合成1对特异性诊断引物，建立了PCR诊断方法。结果扩增出了犬巴贝西虫18sRNA基因
的一段大小为319 bp片段，经测序，所扩增序列与报道的序列完全匹配。同时对附红细胞体、巴氏杆菌DNA样品进行扩增没有出现扩增条带。阳性犬全血DNA稀释1 000倍后，依然可以有效地
检测出虫体DNA。结果表明，所建立的PCR检测方法，具有极高的敏感性和特异性，可以运用于临床检测巴贝西虫病。
关键词：PCR；犬；巴贝西虫；18sRNA基因
中图分类号：S829．2               文献标志码：A                       文章编号：1004—3268(2012)05—0158—03

 

Establishment of A PCR Assay for Detecting Canine BabesiaSHANG Ze-song，LI Xiao—kang，WANG Xue-ying，ZHANG Cai，
JIANG Feng-wei，ZHA0 Yan-hui
(College of Animal Science and Technology；Henan University of Science and Technology，
Luoyang 471003，China)

Abstract：One pair of specific primers was designed according to the  18sRNA gene sequence of  canine Babesia，and then a PCR assay was established for detecting canine Babesia．A fragment in  length of 319 bp was amplified by PCR and the sequence homology to those from GenBank was 100％．NO PCR products were amplified from  purified DNA of Eperythrozoon or Pasteurella．This method can detect the genomic DNA of Canine Babesia in 10^-3 diluted whole blood DNA of  infected dogs．This indicates that the PCR method was precise，sensitive and specific．

Key words：PCR；dog；Babesia；18sRNA gene

巴贝西虫病是广泛发生于各种家畜、经蜱传播的一种血源性原虫病。巴贝西虫在家畜体内单个或成对寄生于红细胞内，引起严重的贫血和血红蛋白尿症。具有关资料显示，引起犬的巴贝西虫病的病原体有3种，即犬巴贝西虫(Babeisacanis)、韦氏巴贝西虫(B．vitlli)和吉氏巴贝西虫(B．gibsoni ) ^[1] 。犬巴贝西虫分布于欧洲、美洲和印度，韦氏巴贝西虫分布于南美洲，吉氏巴贝西虫分布于亚洲。我国主要流行的虫种为吉氏巴贝西虫，该病在国内广泛分布，有蜱滋生的地方，春、夏、秋季均可发病。目前，血液梨形虫诊断方法主要有涂片染色镜检、酶联免疫反应、间接荧光、多聚酶链式反应(PCR)等。涂片染色镜检法虽然设备简单、操作简便，但检测率低，并且在检测隐性带虫感染时则易出现假阴性现象^[2] 。血清学诊断法的缺点是不能区别出是现在
感染还是过去感染。PCR技术则以其较强的特异性和较高的敏感性被学者认为是检测巴贝西虫的最有效方法^[3] 。鉴于此，本研究以PCR技术为基础，根据GerdBank中收录的犬巴贝西虫18sRNA基因序列设计了一对引物，并建立了PCR快速检测方法，旨在为建立有效的巴贝西虫病检测方法和为巴贝西虫病流行病学调查提供良好的方法学基础。

收稿日期：2011一11—16
基金项目；河南科技大学SRTP项目(2009102，2010244)
作者简介：尚泽松(1987一)，女，河南周口人，在读硕士研究生，研究方向，小动物医学。E—mail：shangzeson9163．corn
*通讯作者：张  才(1979一)，男，天津人，讲师，博士，主要从事兽医临床教学和科研工作．E—mail：hucaia@sina．corn

1 材料和方法1．1样品来源吉氏巴贝西虫阳性DNA样品由河南科技大学临床兽医实验室保存，附红细胞体、巴氏杆菌DNA样品由河南科技大学预防兽医实验室提供，疑似病犬血样采自于维特动物医院。
1．2主要试剂   全血DNA提取试剂盒、TaP聚合酶、dNTP、DNA Marker均购自TaKaRa公司。
1．3引物设计合成   根据GenBank报道的巴贝西虫18sRNA基因序列，设计合成巴贝西虫特异性PCR引物1对。上游：5’一GTAATTCCAGCTCCAATA一3’，下游：5’一TTTCGCAGTAGTTCGTC一3’，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。理论扩增片段为319 bp，片段中包含吉氏巴贝西虫与犬巴贝西虫、韦氏巴贝西虫的差异序列。
1．4 DNA的抽提纯化   于犬前肢隐静脉取300µL抗凝血，按说明书进行操作提取纯化DNA。
1．5 PCR扩增   PCR反应体系为50µL。即10 x PCR Buffer5µL、10 mmol／L的mix dNTP 4µL、上下游引物(10 pmol／µL)各1 µL、TaKaRa Taq(5 U／µL)0．25µL、模板DNA 1µL，加双蒸水至50µL。反应程序为95℃预变性5 min；95℃变性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸45 s，进行35个循环；最后72℃延伸7 min，4℃结束反应。反应结束后取5µLPCR产物在2．0％EB染色的琼脂糖凝胶上电泳。电泳后，紫外灯下观察结果。
1．6 PCR产物克隆、测序及序列分析 对阳性样品进行回收，回收产物与pMD一18T载体连接，经大肠杆菌DH5a转化后培养于氨苄青霉素的LB平板上，选择抗氨苄青霉素的菌斑进行
扩大培养，抽提质粒经酶切和PCR鉴定后送至TaKaRa测序生物公司进行测序。
1．7 PCR特异性测定  以犬巴贝西虫DNA为阳性模板，对健康犬血的DNA(阴性对照)、灭菌三蒸水(空白对照)、巴氏杆菌、附红细胞体进行PCR扩增。
1．8 PCR夏敏度测定   将检测阳性的全血DNA样品倍比稀释为10^-1、10-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的样品，分别用相同的反应体系进行PCR扩增，检测PCR的灵敏性。

2结果与分析2．1 PCR产物克隆、测序及序列分析结果  以提取的DNA为模板，扩增18sRNA基因片段。由图1可以看出，该PCR引物可扩增出片段约319 bp，与预期结果一致。将片段经过纯化、克隆、
序列测定，并将所得序列在NCBI上进行BLAST序列同源性比对分析，结果该片段与报道的吉氏巴贝西虫18sDNA基因序列100％匹配。

 

2．2 PCR特异性由图2可以看出，阳性犬PCR可以扩增出DNA片段，阴性对照和灭菌三蒸水无DNA条带出现，也未扩增出附红细胞体、巴氏杆菌的DNA条带，说明本试验建立的PCR方法具有很高的特异性。

2．3 PCR灵敏度测定   由图3可以观察出阳性犬样品PCR结果和阳性犬DNAl0^-1～10^-3稀释样品PCR结果均在同一条带线水平位置上，阴性犬样品PCR无DNA条带显示，结果分析：当阳性犬血DNA样品1 000倍稀释时，该方法依然能够扩增出相应的条带，证明该方法具有较高的灵敏度。

3 讨论本试验结果表明，采用PCR反应系统可以检测出犬巴贝西虫病提取纯化的DNA；特异性试验表明，除犬巴贝西虫的特异扩增带(319 bp)外，其他的虫株和灭菌三蒸水等对照组均未出现特异性扩增带；而且敏感性试验在稀释DNA样品1 000倍后还可以扩增出目的基因，说明所建立的犬巴贝西虫PCR检测方法具有较好的特异性、敏感性以及准确性。由于PCR检测方法的敏感性高，很容易有假阳性的出现，因此要避免样品之问的相互污染、样品对试剂的污染和环境对样品的污染。PCR技术将该病的诊断提高到分子和基因水平，而且在诊断上较传统方法具有更强的特异性和
更高的敏感性，有利于尽早准确地对犬只做出诊断，并及时对其进行治疗，为有效控制该病的流行和发生提供可靠的科学依据。