深度解读 | 微生物培养、鉴定及药敏的技术判读与应用 赋能临床价值
2022/4/8

从经验医疗转化为循证医学的过程,是兽医界同仁们都在经历的过程。

在微生物感染的治疗中,循证医学的理论不仅告诉我们任何医疗决策都应建立在最佳科学研究证据基础上,还可以让我们更有意识的有效控制抗生素滥用,以免超级细菌的产生。

随着微生物检测工作的技术与理论的普及,许多兽医开始认识到微生物感染时进行微生物培养与药敏试验的重要性。药敏试验目的是筛选敏感抗生素以达到有效的抗菌治疗,从而缩短治疗周期,减少动物痛苦。

临床医师应根据药敏试验结果,合理选用有疗效的药物进行治疗,才能收到良好的疗效,药敏试验也是院内感染和流行病学调查的有力手段之一,可监视耐药菌株的逐年药敏动态变化,有助于医院制定防治方案,避免用药不当而产生耐药菌株或增强原有耐药菌株耐药性,给治疗带来困难。

目前宠物临床诊疗中,经验性选择药物还是比较常见的,一旦机体产生耐药后,再考虑药敏实验有可能已经错过治疗的最佳时期。


目前,拓瑞实验室可进行细菌常规培养、鉴定与药敏试验,酵母样真菌培养、鉴定与药敏试验,皮肤病原真菌检测,这三类常见微生物检测手段。

本文主要阐述细菌培养与药敏的报告解读、临床常见困惑答疑、治疗效果和体外药敏不一致的原因 。

细菌常规培养(属于有氧培养),是针对各种常见病原菌的一种检测方法。使用体外试验的方法检测可能致病的病原菌。通过划线分离培养(图1)、增菌培养、可疑菌落纯培养并运用选择培养基的选择性(图2),以此方法培养出可疑病原菌。

进一步通过革兰氏染色将细菌分为两类:革兰阳性菌、革兰阴性菌;通过镜下形态观察,确定是否为革兰阳性球菌或革兰阴性杆菌(图3)。

下一步,会通过初步的触酶试验,将革兰阳性球菌分为葡萄球菌属和链球菌属;通过氧化酶和O/F发酵试验将革兰阴性杆菌分为肠杆菌属和非发酵菌属。最后在细菌鉴定与药敏分析仪中进行最终的生化鉴定(图4 )。



图 1 肠杆菌属在血琼脂上形态

图 2 大肠埃希菌在MAC上形态


  图 3 革兰阳性链球菌


  图 4 可报告菌部分节选



细菌鉴定结果确定后,将会进行针对该菌种的药物选择以及药敏试验。实验室参照美国实验室标准委员会(NCCLs)的最新标准进行药敏试验。根据不同病原菌、病原菌所在部位和给药途径,以及药代动力学选择有代表性的药物做药敏试验。将药敏试验分为首选药、次选药和尿路感染药物。

首选药是针对不同病原菌的最佳选择,次选药是患宠对首选药不敏感或患宠对该药过敏或禁忌使用的情况下选用,尿路感染只限于尿路感染时选用。

图5 一株MRS阴性的葡萄球菌的药敏试验报告


报告解读:

A组
包括常规报告、首选试验的药物组合,以及一些对特定菌群的常规试验报告。

B组 包含一些可以用于首选试验的药物。但是,它们只是被选择性地报告,例如当细菌对A组同类药物耐药时,可以选用。

C组 包括替代性或补充性抗微生物药物,可在以下情况进行试验:某些单位机构内潜伏有对一种或数种基本药物(特别是对同类的,如β-内酰胺类)耐药的,局部流行或广泛流行的菌株;治疗对首选药物过敏的患者;治疗少见菌的感染(如氯霉素对肠道外感染沙门菌属分离株或某些对万古霉素耐药的肠球菌);或有助于流行病学的感染控制报告。

U组 (“泌尿道”) 列出了某些仅用于治疗泌尿道感染的抗微生物药(如呋喃妥因和某些喹诺酮类药物)。除泌尿道外,其它感染部位分离的病原菌不用此组药物进行试验。其他有更广泛适应症的药物可以包括在U 组中用于治疗特殊的泌尿道病原菌(如,铜绿假单胞菌)。

O组 ( “其它” ) 对该组细菌有临床适应症,但在美国一般不常规试验与报告的候选。

Inv 组( “研究性” ) 对该菌群作研究用且尚未经FDA批准的药物。

对于结果通常使用敏感(S)、中介(I)、耐药(R)来表现。报告中的敏感、中介或耐药,其定义如下:

敏感(S)“敏感”类 表示当对感染部位使用推荐剂量时,该菌株通常被抗微生物药物浓度可达到的水平所抑制。

中介(I)“中介”类 包括这些菌株,其抗微生物药物MIC 接近于血液和组织中通常可达到的水平,而抗微生物药治疗的反应率可能低于敏感株。“中介”分类意味着药物在生理浓集部位具有临床效力(如尿液中的喹诺酮类和β-内酰胺类)或者可用高于正常剂量的药物进行治疗(如β-内酰胺类)。此分类还包括一个缓冲区,它可以避免微小的、未能控制的技术因素造成重大的结果解释错误,特别是对那些药物毒性范围窄的药物。

耐药(R) “耐药”类 是指按常规剂量表,在抗微生物药通常可达到的浓度时,菌株不能被抑制;或/和表明抑菌圈直径缩小到菌株可能产生了特殊的微生物耐药机制(如β-内酰胺酶)的范围内,并且治疗研究显示药物对菌株临床疗效并不可靠。

当需要对报告进行解读时,需要注意以下几点:

?. 细菌自动分析仪的药敏组合是固定的。(所以我们需要进行菌种鉴定,因为每种菌所对应的药物选择是不同的)

?. 某些细菌对某类药物存在天然耐药,则不需要做药物敏感试验。(如肠球菌对头孢天然耐药,再次印证对于不同菌的抗生素选择很重要,如果盲目的去做药物敏感试验,有时结果可能并不能反映真正的情况)

?. 试验的药物代表的是一类药物,而不是只代表该种药物。(例如 图6 中,青霉素与苯唑西林可以预测大部分β-内酰胺类药物,并检测是否存在多重耐药)

?. 因为是体外药敏试验,有些药物体外敏感,可能临床治疗无效

?. 同一菌株可能出现亚种,导致连续药敏试验不同。(所以非相同标本的药敏试验进行实验室间对比并无意义)

图6 实验室检出的一株MRS阴性的葡萄球菌的药敏试验报告






当我们了解了以上几点后

再一起看看实验室与临床沟通时常见的问题

集合 7个临床常见困惑 解答






Q1:为什么我们想用的药物在药敏试验中没有做?


A1:1)可能为天然耐药;2)可能是药物敏感性被其他药物所预报。



Q2:为什么有的细菌报告很多种药物,有的仅报告几种?


A2:报告的药物种类由细菌种类决定,如铜绿假单胞菌报告的药物种类多,而嗜麦芽窄食单胞菌报告的药物种类少。(再次强调菌种鉴定的重要性)


Q3:是否能将使用的药都做药敏试验?


A3:没有必要也不太可能。

1)通过耐药机制和标志性药物可以预报其他抗菌药物敏感性;

2)并不是所有药都可以做药敏试验,需要药物在体内稳定,并具有操作标准和解释标准才可。




Q4:培养阳性的细菌都需要进行抗生素治疗吗?


A4:培养阳性≠感染,可能为污染菌或定植菌,任何结果需要结合临床情况进行评价。感染部位的清创、引流、换药有时要比药物治疗更加重要……


Q5:为什么药敏试验敏感的药物,在临床治疗中无效?


A5:体外药敏试验只能预测体内治疗效果,可以理解为耐药=治疗无效。


敏感≠治疗有效。

其原因可能为: 1)可能不是真正的致病菌,(污染菌或定植菌);2)细菌本身产生诱导耐药机制或生物被膜;3)感染部位与药代动力学因素;4)细菌的MIC,给药的剂量和给药方式因素;5)药敏试验中有些药物单独使用无效,需要其他抗生素联合用药; 6)药物剂型及生物利用度因素。




Q6:涂片镜检结果与培养结果不吻合?


A6:1)涂片镜检为所有可检见的细菌。而培养的目的在于检出致病菌;2)一些苛养菌需在特殊环境下才可生长。


Q7:取的明显就是脓液标本,报告为何是阴性?


A7:1)实验室目前开展的为常规微生物培养,是有氧培养,如果为厌氧菌感染则培养阴性;2)可能细菌被大量中性粒细胞吞噬。




治疗效果和体外药敏不一致的原因
准确判读与规范操作


由于机体处于复杂的微生态环境,微生物培养、鉴定、药敏试验的结果解读对临床意义重大。

在临床工作中,需规范送检、运送、培养、鉴定、药敏流程。每个细节都会对结果造成巨大影响。如诊断导管相关感染时,临床需同时送检外周血培养和导管血,必要时送检导管尖。但临床对血培养的送检量、频率、时机,概念不是特别清楚。

而微生物室对结果判读、解释缺乏有效的机制。例如正确的导管尖端培养结果解读应当是:菌落计数>15 CFU(提示CRS),包括G+b;进行鉴定、药敏;菌落计数<15 CFU,仅鉴定一种重要的菌(如白念、A群、G-b);如菌量太大,报告>100 CFU,当分离出金葡或G-b时,而未送血培养,应建议“请送血培养以诊断是否发生导管相关感染”。半定量平皿96h出报告(要参照血培养)。

 ▼治疗效果和体外药敏不一致的原因

1. 抗菌药物的应用会明显降低培养的阳性率。强调在使用抗生素前留取标本。

2. 标本的正确采集和运输常常是微生物诊断技术成功的关键所在。以痰培养为例,通过涂片镜检发现不合格者不做培养,合格标本培养在3+~4+的菌才有可能是致病菌。血培养检查标准的采血方式是每个穿刺部位分别接种需氧和厌氧两个瓶子,至少2个穿刺点,寒战前1h抽血的阳性率较高。罕见的病原菌如放线菌、奴卡菌引起的皮肤软组织感染,组织标本培养的阳性率明显高于单纯脓液的培养。标本需及时送达实验室并及时处理,否则会造成假阴性或假阳性的结果。

3. 虽然无菌体液如血、脑脊液较呼吸道标本更可信,但无菌部位的培养也可能会污染。凝固酶阴性葡萄球菌已成为血和无菌体液培养中最常见的病原菌,有数据显示其污染率高达80%以上。

4. 呼吸道标本在判断污染或感染时常感困难。很多念珠菌可能只是定植而不是感染,需要结合临床判断。

5. 微生物学检查结果需详细了解送检标本的质量、次数、病原检出时间、不同部位的培养结果等,同时结合临床表现综合判断。

6. 药敏判定折点需要及时更新,特别要参照美国CLSI文件。

 

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